无菌制剂容器密封性测试方法汇总

     无菌 药品在使用前的无菌保证，是药品管理法规的要求。因此，必须有容器完整性（Container Closure Integrity-CCI）的验证和监测，以确保在无菌药品生产，质控，运输和储存，乃至产品有效期的整个生命周期过程中，产品不受微生物的污染，确保病人用药安全。目前各个国家的药政法规，都有提供容器完整性CCI的测试方法，但是没有提供具体细节，指导如何合理的选择方法，及评价一个无菌药品包装系统( Container Closure System-CCS)的完整性。方法的合理选择，以及科学的制定一个可接受的标准，和产品的性质和包装系统密不可分。欧洲医药同盟多次开会探讨容器完整性测试的最佳方法，却得出结论，并不存在容器完整性测试的一个黄金标准，在考虑无菌制剂的既定用途和产品设计的基础上，需要采取一个灵活的方法，来评估产品的包装容器完整性。

   美国药典修订了容器完整性测试（Container Closure Integrity Testing-CCIT）的通则方法USP<1207>。这个修订缘于上世纪70年代的一个医疗事故，当时美国雅培工厂的一个静脉输注产品的包装系统做了更换，在医院注射此产品的病人广泛爆发败血症，导致10%的病人因此死亡，经调查证实更换的包装系统存在密封完整性的缺陷，使产品遭受微生物污染。这个悲剧事件，以及不断提升的药政监管要求，强调了制药企业确保无菌制剂包装完整性的重要性。

方法简介和选择依据

   根据USP通则<1207>，将容器密封完整性测试的检测方法分成确定性和概率性两种类型。确定性检测方法包括：高压泄漏检测法，激光顶空分析，氦气泄漏测试，质子流法，压力衰减法，真空衰减法，和Corona电极放电法。概率性检测方法包括：气泡发射法，色水法，和微生物挑战法。

   每个方法有其不同的灵敏度以及选择参考点。制药企业需要把包装系统CCS作为药品开发的关键质量属性之一，用质量源于设计（Quality by Design-QbD）的理念，在药品设计到生产的整个生命周期内，基于不同阶段药品有不同的应用目的，选择合适的、CCIT方法。在选择CCIT方法的时候，必须充分理解内包装的材料特点，制作工艺参数，和操作中的控制方法。此外，对于容器密封性的可接受标准，在不同的产品发展阶段也会有所不同。

在选择一个合适的容器完整性测试CCIT方法的时候，需要考虑以下因素：

-     方法的既定用途，即，用于包装系统的开发和确认，还是商业生产阶段的过程控制或验证，还是稳定性测试；

-       包装系统开发前的认知，即，是开发该产品和包装系统，还是改进一个新产品的包装系统；

-       包装系统的形式，即，小玻璃瓶，注射器，药品和医疗器械的复合制剂，还是静脉点滴用袋子；

-       包装系统的材料，是延展性材料，玻璃，还是高分子聚合物；

-       药品的类别，即，液体制剂，冻干粉制剂，小分子产品，还是大分子产品，水相制剂，溶剂制剂，还是油相制剂，产品导电性如何，产品黏度，顶空气体的组成，常压，还是真空包装，或是过压包装；

-       测试时间长短的考量；

-       要求的方法灵敏度；

-       样本做人工泄漏的可行性和人工泄漏方式

-       用于专属研究的样本量；

-       样本制备的考量，以及样本制备带来的潜在风险，比如需要移除标签，或需要排空小瓶，或需要清洁小瓶。

在很多情况下，包装密封性测试方法的最初选择，是基于某特定测试技术的经验。随着制药企业经验的积累，类似产品或包装的参考，还有文献的参考，以及行业标准和指南文件的指导，在产品开发到发展的整个生命周期，会采用不同的测试方法。在测试方法选择上，还需要考虑以下因素：

・对测试样本的破坏性还是非破坏性；

・测试的方法是内联，在线，离线，还是近线；

・测试的有效性考量，包括测试速度（比如单位时间内的测试量），测试的产出（包括样本平衡的时间和控制组的测量）

・ 测试频率和计划：只需要测试一次还是需要多次，比如需要在稳定性方案中测试（气体渗透的潜在影响）；

・测试成本，包括设备的购买，方法和设备的验证，测试条件的维护成本；

・用于测试装载的包装系统，还是空载的包装系统

・是否干扰药品的理化测试；

・方法操作的特点：灵敏度，方法的耐用性，精密度，和准确度；

・测试结果的表述方式：通过/失败（即，判定是否存在超过方法灵敏度的泄漏），泄漏位置的标记，还是能定量的测出泄漏孔的大小或泄漏流量；

・ 泄漏样品带来的设备污染风险。

  不管选择哪个测试方法，测试仪器都需要经过校验，测试方法也需要通过验证，测试方法的系统适用性试验，应该包括阳性控制（即已知泄漏的样本）和阴性控制（即没有人工泄漏的样本）。

方法特点和应用范围

下文将对各种常见测试方法的优缺点和应用范围做详细探讨。

1）高压泄漏检测法

   High-voltage leak detection

这是一种确定性的泄漏测试方法。高压电检漏是基于定量的电导测试，要求容器内灌装的液体有一定的电导率，在待检品上外加高压电，泄漏点的存在导致样品电阻的下降，从而导致电流的突跃，当然这个电流应该大于预先确认的方法检测阈值（通过/失败判定的灵敏度）。

该方法的优点：

-       不需要破坏样本

-       可以做到100%的在线测试

-       高速的测试

-       不需要测试前的样品制备

-       其准确性独立于员工的操作技能

-       在常压下测试

该方法的缺点：

-       只有通过/失败两种结果，没有定量的结果

-       药品本身的电导应该大于包装材料的电导

-       有可能破坏到产品（比如引起蛋白质的降解）

-       制剂液体必须不是易燃液体

-       测试过程会产生臭氧

-       对于特定的包装系统，需要的固定装置

-       电极必须离泄漏点在一定的距离内

-       药品液体需要和泄漏点接触或者非常靠近

-       产品堵塞泄漏孔会导致测试结果不准确

-       不适用于冻干粉制剂产品

该方法的应用范围和建议：

-       对于商业化生产线的高产出的检测。

-       需要评估产品接触到高压后的质量影响。

-       在长期稳定性样品的泄漏测试上受限，这主要是由于长期储存过程中液体风干堵塞泄漏孔。

-     产品的电导可能不足以检测出泄漏

-     可以把100%的在线检测模式整合到自动目测检查的生产线中。

-       在100%的在线测试中依旧受到限制，这主要是由于方法有其灵敏度，只能测试到大于灵敏度的泄漏。

-       当泄漏点在小瓶的顶端位置，比如在闸盖处，没有和液体产品接触到，该方法就不适用。

2）激光顶空分析

   Laser-based headspace analysis

这是一种确定性的泄漏测试方法。激光法是通过监测容器顶空压力、水汽和顶空氧变化来判定容器的完整性，原理是发射的激光穿透容器顶空，容器顶空的水汽和氧对激光有吸收，激光吸收量和对应的物质含量成正比。顶空水汽的吸收峰宽度和顶空压力成正比，因此可以通过顶空水汽的吸收峰宽来获得顶空压力。

该方法的优点：

-       不需要破坏样本

-       可以做到定量测试

-       可以做到100%的在线测试

-       高速率的测试

该方法的缺点：

-       包装容器必须是透明的

-       需要在包装瓶的顶空有可以改变的气体环境

-       需要顶空部位有一定的空气体积供于检测

-       在探测小尺寸的泄漏上，会延长测试的时间

-    变更设备的部件时需要包含所有不同的尺寸和型号

该方法的应用范围和建议：

-       对于微米级孔径大小的泄漏，测试可能需要耗时几周的气体交换。

-       测试方法方便使用

-       可用于评估瞬间发生的泄漏（比如测试需要低温储存的产品）

-       有可能导致错误的测试结果，尤其是在稳定性研究中，由于气体的渗透或被液相吸收。

-       由于快速的和环境压力平衡，大尺寸的泄漏可能无法测出（比如测试低温储存的产品）。

-       不容易区别出不同尺寸的泄漏。

-       不容易甚至不能够测试出在液面下的泄漏，因此，只适用于预灌注注射器。

-       冻干粉制剂产品可能会导致泄漏的堵塞。

-       有部分的压力依赖于温度。

3）真空衰减法

   Vacuum decay

这是一种确定性的泄漏测试方法。真空衰减法是将包装容器置于专门的测试腔体内，对测试腔体抽真空，容器内外压差使得容器内部气体通过漏孔泄漏进入测试腔体，主机压力传感器监测到压力的变化，将压力变化值和参考值做比较，压力增大说明存在泄漏，以判定容器密封完整性是否格。此方法的测试步骤包括：抽真空、保压和测试。

该方法的优点：

-       不需要破坏样本

-       可以做到100%的在线测试

-       高速率的测试和产出

-       测试不会影响生产进度

-       有ASTM方法可供参考（ASTM-American Society for Testing and Materials）

-       可适用于液体和冻干粉的制剂

-       可应用于有色包装瓶和贴好标签的包装瓶检漏

该方法的缺点：

-       仪器昂贵，每种包装系统需要特定的仪器腔体

-       产品堵塞泄漏孔的情况下会检测不出泄漏

-       真空腔体的准备至关重要（湿度会影响测试结果）

该方法的应用范围和建议：

-       此方法适用性很广，可用于支持产品开发，商业化，以及稳定性研究各阶段，包装容器的密封性检查。

-       适用于液体和冻干粉的制剂。

-       可应用于包装器械的测试，和贴好标签的包装瓶检漏。不过，相对于未贴标签的初级包装，其检测灵敏度是降低的。

-       只限于在线测试，并会产生假阳性结果（比如，当有滞留气体在闸盖处时；或者受到湿度波动的影响时）。

-       方法开发研究表明，该方法对冻干粉，预灌注液体的注射器，和小容量瓶液体制剂具有等同的灵敏度。

-       当应用于液体制剂时（黏度限制），镭射穿孔的阳性控制样本容易出现堵塞的情况；对预灌注注射器，细孔也很容易被蛋白质或硅油堵塞。

-       压力变化和泄漏的尺寸，泄漏的速率有量级的相关性。然而，无法区分泄漏是来自于多个泄漏小孔还是单个，或者是包装连接处的裂缝。

4）微生物挑战法(浸入或气溶胶挑战)

   Microbial immersion or aerosol challenge

这是一种概率性的泄漏测试方法，此检查通常与模拟灌装同时进行。通过按照模拟灌装验证方案进行培养基模拟灌装，然后进行压塞轧盖后，目检合格，经已验证的灭菌柜灭菌后，将容器密封面浸入到高浓度的菌液中，使样品容器内的培养基充分接触封口内表面，样品的颈部及封口的外表面应*浸泡在菌悬液中，浸泡一定时间后取出，定期培养后检查是否有微生物侵入，以确定容器密封系统的完整性。同时，需要做阳性对照试验，确认培养基的促生长能力。测试中通常会运用真空或过压的挑战条件。

该方法的优点：

-       数十年来获得广泛应用。

-       是整个行业和法规熟识的做法。

-       可以与模拟灌装结合，同步进行。

-       对产品特性的直接评价（即，确保容器密封性可以使产品免受微生物污染）。

该方法的缺点：

-       对样品的破坏性。

-       只有通过或失败的结果，没有定量测试。

-       不可能进行100%的样本测试。

-       测试会耗时数周。

-       需要比较多的劳动力。

-       只能适用于可以做培养基罐装的包装系统。

-       可能会导致假阳性或假阴性的结果；测试的灵敏度部分依赖于分析员的操作技巧。

-    对于微小瑕疵，测试具有随机性。

-    不同国家地区，对于培养基，所用菌种和测试方法还没有统一。

该方法的应用范围和建议：

-       此方法的检测限随着以下因素波动：泄漏的大小，包装材料，菌种，培养基和挑战条件。

-       一直被用来建立关键的泄漏点（根据其泄漏的速率或大小）。

-       浸入法比气溶胶挑战法更普遍，方法条件更容易达到，有更好的重复性。

-       不使用真空或过压的条件，自然放置几周时间再检查，更具有代表性，不过耗时。

-       如果使用真空或过压的条件，可以加速测试，数小时内就可以做检查，这种方式可以代表运输条件，减少测试时间。

5）染色浴法

   Dye ingress

这是一种概率性的泄漏测试方法。将密封容器*浸没在染色浴中，也可在染色浴中加入表面活性剂，对整个测试腔体进行抽真空。如果该容器有裂缝，空气就会从瓶中溢出。然后解除真空，这时泄漏容器内存在负压，染色溶液会从裂缝中进入瓶内部，再对测试腔体加正压，提高染色液的渗入性，通过分析员或仪器目检剔除变色的容器。

该方法的优点：

-       数十年来获得广泛应用。

-       有ASTM和ISO的标准方法。

-       是整个行业和法规熟识的做法。

-       基础并且有效率。

-       可灵活应用，同时测试不同包装容器的泄漏情况。

-       可以看出泄漏的位置。

-       泄漏位置可以在液相中。

该方法的缺点：

-       对样品的破坏性。

-       只有通过或失败的结果，没有定量测试。

-       不可能进行100%的样本测试。

-       必须是透明的包装系统，用于目测判断。

-       如果样品体积本身比较大，只进入很少的染色水，有时不容易分辨出来。

-       对于微小瑕疵，测试具有随机性。

该方法的应用范围和建议：

-       方法具有多用途，可以测试初级包装和外包装，用来支持产品开发阶段，商业化生产，和稳定性研究阶段的检漏测试。

-       直接检测相关泄露

-       可以运用不同的染色剂。

-       如果运用优化的真空/加压循环工艺，可以提高测试的灵敏度。方法的检测限随着以下因素波动：泄漏的大小，包装材料，染色液的浓度，和挑战条件。

-       染色液必须是易混合的而且不和产品发生化学反应。

-       可以把同样的挑战条件应用到微生物侵入试验法中。

-       对于液体制剂应用良好，但基于染色液的限制，可能对冻干制剂不适合 。

人工穿孔的技术讨论

上述讨论的检漏方法，都需要做方法验证，需要有明确泄漏的样本来做阳性控制，以挑战方法的检漏能力。对于样品的人工穿孔，有以下几个常用的方法：

-       镭射穿孔，直接穿透包装容器本身

-       镭射穿孔，穿透在和包装容器相连的金属片或管 （laser drilling into a metal plate or tubing that is integrated to a CCS ）

-       微米级的金属丝插入到容器中

-       微量吸管插入到胶塞或连接到容器的一个人工小孔上

-       毛细管（熔融硅，镍或玻璃）插入到胶塞或连接到容器的一个人工小孔上。

每一种方法都有其挑战性，包括穿孔尺寸的限制，穿孔形状不规则，穿孔大小难以测量，微小穿孔容易被立即堵上，造价高等等。目前行业内没有标准来规定穿孔技术和孔径测试的方法。在建立容器密封性测试方法的时候，每个公司需要对自己建立的方法做合理性的说明，采用适当的方法。

结论

随着修订版USP<1207>的执行，对于包装容器密封性测试（CCIT）会有更多深入的调查，生产无菌制剂的企业需要符合不断发展的法规期望。对于CCIT的测试方法和可接受标准，目前行业给予企业一定的灵活性。正如上述讨论，每个方法都有其优缺点和适用性，市面上的测试仪器也有其各自的优缺点，因此，制药企业有责任根据产品自身的特点和产品的不同发展阶段，采用风险评估的方法，选取并验证合适的检漏测试方法，并建立泄漏的可接受标准。

表1. 五种泄露检测法综合评价

表2. 五种泄露检测法详细描述